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脂質(zhì)-配體相互作用工具:脂質(zhì)不再是可怕的中間體

發(fā)布時(shí)間: 2023-09-08  點(diǎn)擊次數: 653次



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      當細胞生物學(xué)家第一次發(fā)現可能有一種脂質(zhì)參與他們最喜歡的途徑時(shí),這有點(diǎn)像在馬路對面找到一堵墻(就像當脂質(zhì)學(xué)家在他們的路上找到一種蛋白質(zhì)一樣……)。

      由于脂質(zhì)的不同性質(zhì),大多數細胞生物學(xué)家都害怕在他們的研究過(guò)程中不得不面對這種情況。好消息是,有一些簡(jiǎn)單的方法可以幫助克服這一障礙,使研究特定途徑中的脂質(zhì)變得更容易。在這里,我想介紹一些脂配體相互作用研究的分析和準備工具。


1 覆蓋試驗Overlay assays-鑒定與給定蛋白質(zhì)相互作用的脂質(zhì)


      這些分析方法允許鑒定一種或多種脂質(zhì)與給定蛋白質(zhì)相互作用。

      與Western-blot原理類(lèi)似,它們的原理是在表面涂上各種類(lèi)型的脂質(zhì),這些脂質(zhì)將與已知的蛋白質(zhì)接觸,這種蛋白質(zhì)將被標記或抗體臨時(shí)檢測到。脂質(zhì)的載體通常是硝化纖維素膜(圖1)。與點(diǎn)印跡法一樣,需要優(yōu)化一些實(shí)驗參數(如緩沖液、蛋白質(zhì)純化或蛋白質(zhì)濃度)。

      當可用蛋白質(zhì)的數量有,小的“覆蓋分析格式"可以用少于0.5 mg的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。這是一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)測試一種感興趣的蛋白質(zhì)對各種脂質(zhì)的結合能力!

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      為了檢查蛋白質(zhì)對各種類(lèi)型的脂質(zhì)的相對親和力,硝基纖維素陣列被標記為每種脂質(zhì)的梯度。幾個(gè)相同的陣列可以證明在測試單特異性或多特異性蛋白質(zhì)有用。該技術(shù)顯示出高特異性(圖2),結果甚至比ELISA試劑盒更干凈,再次強調了實(shí)驗條件優(yōu)化的必要性。



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      對于那些對膜不熟悉的人,或者正在研究大量蛋白質(zhì)的人,也可以使用聚苯乙烯板,用各種類(lèi)型的脂質(zhì)共價(jià)涂覆(稱(chēng)為COVA板)。用于高含量篩選的微陣列板格式允許您在單個(gè)板上測試具有不同脂質(zhì)的幾種蛋白質(zhì)(親和性)。平板的每孔都有9種不同的脂質(zhì),用于檢測先前標記或通過(guò)免疫檢測的蛋白質(zhì)。圖3所示的是一個(gè)蛋白質(zhì)結構域(已知與兩種不同的脂質(zhì)相互作用)。對于前面介紹的設置,需要優(yōu)化蛋白質(zhì)濃度。



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2 下拉試驗Pull-down assays-發(fā)現一種已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伙伴


      對于相反的實(shí)驗設置,當您想要識別已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伴侶時(shí),瓊脂糖為基礎的下拉試驗等制備技術(shù)將是您的選擇:

*瓊脂糖珠包被確定的脂質(zhì)可以被進(jìn)一步孵育與細胞裂解液,上清液,重組蛋白…

* 然后相互作用的復合體通過(guò)離心將它們拉下來(lái)。

       它允許分離脂質(zhì)結合蛋白的數量適合進(jìn)一步鑒定和表征。它經(jīng)常與細胞裂解液一起用于“撈出"脂質(zhì)對偶物(圖4)。

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3 漂浮試驗Floatation assays-用于更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用


       當你在尋找更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用時(shí),另一種基于脂質(zhì)富集脂質(zhì)體(用作脂質(zhì)/配體相互作用的基質(zhì)支持)的制備方法是可用的。

       與GEM脂筏提取(葡萄糖梯度超離心)類(lèi)似,脂質(zhì)體預結合到脂質(zhì)配體上,將沿著(zhù)超離心制備的葡萄糖梯度分成幾個(gè)部分分布(圖5)。

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這些富脂脂質(zhì)體有許多優(yōu)點(diǎn):

*聚脂質(zhì)體PolyPIPosomes是聚合的脂質(zhì)體,

*增加穩定性(長(cháng)達6個(gè)月),

*生物素標簽,方便鏈霉親和素檢測,

*尺寸均勻(~200 nm),可進(jìn)行浮選試驗,

*這些脂質(zhì)體也可用于:表面等離子體共振,脂質(zhì)體覆蓋分析,ITC。


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默瑞生物

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